F₁₀+ %20HSA Ham^,s

۱۰ ml

sucrose

۰/۸۶ gr

جدول۲-۷- مواد مورد نیاز برای ساخت محلول شستشو

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

نوع ماده

میزان مورد نیاز

F₁₀+ %20HSA Ham^,s

۱۰ ml

۲-۷-۱ پیپت های مخصوص جا بجا کردن رویان ها
از پیپت پاستور بلند استفاده شد به این ترتیب که پیپت بالای شعله ی آبی رنگ نگه داشته شد به محض اینکه شروع به نرم شدن کرد از روی شعله برداشته و بلافاصله کشیده شد، برای جلا دادن نوک پیپت، نوک آن در عرض کمتر از یک ثانیه روی شعله آبی رنگ قرار گرفت و سپس پیپت به پیپت دهانی متصل گردید. برداشت رویانها و بارگیری آنها توسط پیپت به این ترتیب بود که ابتدا مقداری محیط کشت کشیده شد تا از نیروی مویینگی موجود در نوک پیپت جلوگیری به عمل آید و سپس به دنبال آن رویان ها برداشته شدند. رویان ها توسط محیط کشت HTF سه بار شستشو داده شدند. برای شستشوی رویانها سه قطره از محیط کشت HTF داخل پتری دیش مسطح قرار گرفتند و روی آنها روغن معدنی در حدی که روی قطره ها را بپوشاند ریخته شد و به این ترتیب رویانها متناوبا در هر کدام از قطره ها قرار گرفتند.
۲-۷-۲- انجماد شیشه ای جنین ها
جهت انجماد ۲یا ۳ عدد از جنین ها را در مراحل مختلف در گروه های مورد مطالعه (به ترتیب دوسلولی، چهار سلولی، هشت سلولی و مورولا) با بهره گرفتن از پیپت دهانی ازمحیط کشت بلوغ (HTF) برداشته و وارد محلول تعادل(ES) کرده که جنین ها به مدت ۴ دقیقه در این شیب غلظت (در دمای اتاق) قرار گرفتند. سپس رویان ها با پیپت دهانی از محلول تعادل برداشته شده و بلافاصله به محلول انجماد شیشه ای (VS) انتقال یافتند و به مدت ۴۰ ثانیه در آنجا (در دمای اتاق) قرار گرفتند و پس از آن بلافاصله جنین ها را با حداقل محیط بر روی استراهای پلاستیکی بارگیری شدند و بلافاصله داخل نیتروژن مایع غوطه ور گشتند و سپس استراها را داخل گوبلت های مخصوص گذاشته و به داخل تانک ازت مایع (LN2) منتقل شدند.(Rienzi et al., 2010; Succu et al., 2007).
۲-۷-۳ ذوب کردن جنینها
به منظور گرم کردن، استراها را با بهره گرفتن از پنس دسته بلند از داخل تانک ازت مایع برداشته و نوک آن را که حاوی جنین ها می باشد داخل محلول ذوب شماره یک F₁₀+ %20HSA),(TS1) Ham^,s غنی شده با سوکروز(۱M قرار داده که به مدت یک دقیقه در این محیط در دمای اتاق قرار گرفتند و بعد از آزاد شدن رویانهای ذوب شده آنها را به محلول ذوب شماره دو%۲۰HSA),(TS2) Ham^,s F₁₀+ غنی شده با سوکروز(۰/۵M منتقل کرده که به مدت سه دقیقه در این محیط در دمای اتاق قرار گرفتند و سپس وارد محلول ذوب شماره سه %۲۰HSA),(TS3) Ham^,s F₁₀+ غنی شده با سوکروز (۰/۲۵M کرده که در این محیط نیز به مدت سه دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند و پس از شستشوی جنین ها در داخل محیط کشت HTF حاوی ۴ میلی گرم BSA به ازای هر میلی لیتر و سپس در قطرات محیط کشت HTF حاوی ۴ میلی گرم BSA به ازای هر میلی لیتر در زیر روغن معدنی از قبل به تعادل رسیده کشت داده و به داخل انکوباتور CO₂ با دمای ۵/۳۷ درجه سانتی گراد قرار داده شدند (Rienzi et al., 2010).
۲-۷-۴- ارزیابی رشد جنین ها
برای ارزیابی مراحل مختلف رشد جنین ها مواد مذکور در زیر میکروسکوپ معکوس^[۱۰۱] مورد ارزیابی قرار گرفت، بررسی میزان شکافتگی ۲۴ ساعت بعد از کشت صورت گرفته و در زیگوت­های موجود در هر گروه، جنین­ها از نظر میزان فراگمانتاسیون و میزان طی مراحل رشد جنینی یا تعداد جنین­های متوقف شده و تیپ­بندی جنین­های متوقف شده با توجه به فاکتورهای مختلفی نظیر لیز شدن جنین­ها و نکروتیک بودن آنها و فراگمانتاسیون و وجود وزیکولهای سیتوپلاسمیک مقایسه گردیدند. تیپ بندی جنین­های متوقف شده به شرح ذیل می­باشد:
تیپ I : جنین­های با لیز، فراگمانته شدن و نکروتیک بودن کامل
تیپ II : جنین­های با لیز و فراگمانته شدن در تعدادی از بلاستومرها
تیپ III : جنین­های با تعداد کمی بلاستومرهای لیز و فراگمانته و ویزیکول سیتوپلاسمیک.
کیفیت جنین­ها و تعداد جنین­های رشد کرده در طی ۱۲۰ ساعت و درصد شکافتگی و میزان جنین­های متوقف شده و درصد بلاستوسیست­های ایجاد شده در هر گروه مورد ارزیابی قرار گرفت. کیفیت جنین­ها و تعداد جنین­های رشد کرده، درصد شکافتگی، میزان جنین­های متوقف شده و درصد بلاستوسیست­های ایجاد شده در طی ۱۲۰ ساعت در هر گروه مورد ارزیابی قرار گرفت.
۲-۸- آنالیز آماری
آنالیز آماری داده ها توسط نرم افزار Minitab (Minitab Co., USA) و روش ۲Proportion با p<0/05 مورد آنالیز قرار گرفت و نتایج بصورت درصد در نمودارها و جدول مربوطه آورده شد.
فصل سوم
نتایج
۳- نتایج
۳-۱- مطالعه نتایج حاصل از پیشرفت مراحل مختلف سلولی،(زیگوت، ۲ سلولی، ۴ سلولی، ۸ سلولی و مورولا) جنین موش سوری پس از انجماد شیشه ای و ذوب
جنین های حاصل از لقاح آزمایشگاهی تخمک و اسپرم موش سوری پس از قرار گرفتن در داخل قطرات کشت و پس از رسیدن به مراحل سلولی مشخص به تعداد مشخص منجمد شده ودر داخل تانک نیتروژن نگهداری می شدند و پس از مدت یک ماه از تانک خارج شده، مراحل ذوب را طی کرده و دوباره کشت می گردیدند تا پیشرفت مراحل متفاوت جنینی بررسی و مقایسه گردد که این نتایج به صورت زیر گزارش می شود.
۳-۱-۱- نتایج حاصل از انجماد-ذوب زیگوت
جمعا ۴۶۶ جنین منجمد شدند که از این تعداد ۸۹ عدد، جنین یک سلولی موش سوری بودند که از این میان پس از ذوب ۸۲ جنین به دست آمدند، که پس از بررسی مشخص شد از این تعداد ۵۹ جنین دارای مورفولوژی نرمال بودند، پس از بررسیهای اولیه جنین ها به قطرات لقاح داخل دیش لقاح توسط پیپت دهانی منتقل شده و در داخل انکوباتور قرار گرفتند. در روزهای بعدی وبه مدت ۵ روز به طور روزانه مورد ارزیابی قرار گرفتند که مشخص گردید ۲۳ جنین دچار لیز شده، ۲۲ جنین دچار شکافتگی^[۱۰۲] شده، ودر کل در روز پنجم بررسی، ۹ جنین به بلاستوسیست تبدیل شده بودند، در کل ۵۰ عدد از جنین ها متوقف^[۱۰۳] شده بودند، که نوع توقف ها به این ترتیب بود که ۲۲جنین از نوع۱ ، ۴ جنین نوع۲ و۲۴ جنین نوع۳ بودند. گزارش این نتایج در جدول ۳-۱ آورده شده است. تیپ I : جنین­های با لیز، فراگمانته شدن و نکروتیک بودن کامل
تیپ II : جنین­های با لیز و فراگمانته شدن در تعدادی از بلاستومرها
تیپ III : جنین­های با تعداد کمی بلاستومرهای لیز و فراگمانته و ویزیکول سیتوپلاسمیک

تصویر ۳-۱- جنین های یک سلولی موش سوری، قبل از انجماد (راست)، بعد از ذوب و کشت(چپ).(بزرگنمایی۶۰×)
جدول ۳-۱- نتایج حاصل از انجماد- ذوب جنین های یک سلولی موش سوری