چاهک های ۱۵-۱: کلونهای نوترکیب دارای ژن gcsf
چاهک ۹: مارکر DNA (kb1)
۳-۳-۵-۳ برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo
برای تأیید نهایی، پلاسمیدهای استخراج‌شده با آنزیم BglIIهضم شدند و محصول هضم آنزیمی بر روی ژل آگارز ۱ درصد الکتروفورز شد (شکل ۳-۱۴).

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۱۵ ۱۴ ۱۳ ۱۲ ۱۱ ۱۰ ۹ ۸ ۷ ۶ ۵ ۴ ۳ ۲ ۱
شکل ۳-۱۴ برش آنزیمی وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo با BglII
چاهک ۱و ۲: pGEM-zeo هضم نشده و هضم شده با BglII (با قطعاتی به طول تقریبی ۱۲۰۰ و ۲۹۰۰ نوکلئوتید)
چاهک ۳ و ۴: pHan-gcsf هضم نشده و هضم شده با BglII (خطی شده به طول تقریبی ۷۰۰۰ نوکلئوتید)
چاهک های ۱۵-۵: کلونهای نوترکیب استخراج شده (با قطعاتی به طول تقریبی ۱۲۰۰ و ۷۰۰۰ نوکلئوتید)
چاهک ۷: مارکرDNA (kb1)
۳-۴ انتقال پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلی مورفا
۳-۴-۱ هضم آنزیمی وکتور بیانی pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا
پلاسمید هضم شده با EcoRI بر روی ژل آگارز ۱% برده شد و پس از تأیید خطی شدن آن (مشاهده باندی با وزن تقریبی ۸۰۰۰ نوکلئوتید) (شکل۳-۱۵)، این قطعه از ژل آگارز تخلیص شده و با روش الکتروپوریشن به سلولهای مستعد هانسونلا منتقل گردید.
۱ ۲ ۳
شکل ۳-۱۵ هضم وکتور نوترکیب pHan-gcsf-zeo با آنزیم EcoRI
چاهک ۱: مارکر DNA (kb1)
چاهک ۲: وکتور هضم نشده pHan-gcsf-zeo
چاهک ۳: وکتور pHan-gcsf-zeo هضم شده با EcoRI (خطی شده به طول تقریبی ۸۲۰۰ نوکلئوتید)
۳-۴-۲ تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسین
به منظور تأیید کلونهای رشد نموده بر روی پلیت حاوی زئوسین (با غلظت µg/ml1600)، PCR اختصاصی ژن زئوسین بر روی کلنی ها انجام شد و باندی به طول تقریبی bp1200 در مورد دو کلنی هانسونلا مشاهده گردید (شکل۳-۱۶).
۱۴ ۱۳ ۱۲ ۱۱ ۱۰ ۹ ۸ ۷ ۶ ۵ ۴ ۳ ۲ ۱
۲۰ ۱۹ ۱۸ ۱۷ ۱۶ ۱۵
شکل۳-۱۶ نتایج PCR اختصاصی ژن زئوسین بر روی کلنی های نوترکیب هانسونلا
چاهک شماره ۱۸: کنترل مثبت PCR ژن زئوسین
چاهک ۱۹: کنترل منفی PCR
چاهک های ۱۴-۱، ۱۵، ۱۶ و ۱۷: کلونهای نوترکیب هانسونلا
چاهک ۲۰: مارکر DNA (kb1)
۳-۷ بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا
در این مرحله پس از کشت سلول‌ها در محیط کشت مایع، بیان پروتئین با افزودن متانول ۵/۰% صورت گرفت. پس از تغلیظ مایع رویی محیط کشت، نمونه ها بر روی ژل SDS-PAGE 15% مورد بررسی قرار گرفتند (شکل ۳-۱۷).
۱۰ ۹ ۸ ۷ ۶ ۵ ۴ ۳ ۲ ۱
kDa25
شکل ۳-۱۷ بررسی بیان GCSF نوترکیب در محیط کشت بیانی هانسونلا
چاهک ۱: سوپ محیط کشت سلول هانسونلا فاقد وکتور نوترکیب (نمونه کنترل منفی) پس از اضافه نمودن متانول
چاهک ۲: سوپ محیط کشت سلول هانسونلا پس از عبور از فیلتر تغلیظ کننده (<50kDa)
چاهک ۳: سوپ محیط کشت سلول هانسونلا پس از عبور از فیلتر تغلیظ کننده (>50kDa)
چاهک ۴: سوپ محیط کشت سلول هانسونلا حامل وکتور نوترکیب (کلون شماره ۷) پس از اضافه نمودن متانول
چاهک ۵: سوپ محیط کشت سلول هانسونلا (کلون شماره ۷) پس از عبور از فیلتر تغلیظ کننده (<50kDa)
چاهک ۶: سوپ محیط کشت سلول هانسونلا (کلون شماره ۷) پس از عبور از فیلتر تغلیظ کننده (>50kDa)
چاهک ۷: مارکر پروتئینی
چاهک ۸: سوپ محیط کشت سلول هانسونلا حامل وکتور نوترکیب (کلون شماره ۱۹) پس از اضافه نمودن متانول
چاهک ۹: سوپ محیط کشت سلول هانسونلا (کلون شماره ۱۹) پس از عبور از فیلتر تغلیظ کننده (<50kDa)
چاهک ۱۰: سوپ محیط کشت سلول هانسونلا (کلون شماره ۱۹) پس از عبور از فیلتر تغلیظ کننده (>50kDa)
۳-۶ تأیید پروتئین نوترکیب تولید شده با روش Immuno-Blotting
با بهره گرفتن از آنتی بادی خرگوشی تولید شده علیه پروتئین نوترکیب GCSF (آنتی بادی پلی کلونال)، ایمونوبلاتینگ انجام شد (شکل ۳-۱۸).
۱ ۲ ۳ ۴ ۴ ۳ ۲ ۱
الف ب
شکل۳-۱۸: وسترن بلاتینگ جهت تأیید بیان پروتئین نوترکیب GCSF در سلول هانسونلا (الف) سرم خرگوشی پس از تزریق؛ (ب) سرم خرگوشی قبل از تزریق
چاهک ۱: پروتئین نوترکیب GCSF تزریق شده به خرگوش