پلی­مورفیسم ژنتیکی، تفاوت در توالی DNAی افراد، گروه­ ها یا جمعیت­ها است که شامل یک یا تعداد بیشتری SNP می­باشد. موتاسیون ژنتیکی، تغییر در توالی نوکلئوتیدی یک مولکول DNA است. استفاده از اکوتیلینگ برای یافتن پلی مورفیسم DNA و تنوع آللی ژن­ها یکی دیگر از موارد کاربرد این تکنیک است. ملحِد و همکاران (۲۰۰۶) از تکنیک اکوتیلینگ برای یافتن پلی­مورفیسم DNA در ژن­های mlo و Mlaی جو استفاده کردند. آن­ها ۱۱ لاین موتانت mloی جو، رقم اینگرید (mlo WT) و ۲۵ لاین جو که شامل ارقامی از اروپا، لاین­های تقریباً ایزوژن و لاین­های مشتق شده از جوی وحشی که دارای آلل Mla بودند را مورد بررسی و آزمایش قرار دادند. این پژوهشگران نتیجه گرفتند که امکان ترکیب آلل­های متفاوت mlo با آلل­های مختلف Mla از جوی وحشی وجود دارد تا بدین وسیله ارقامی با مقاومت طولانی­تر نسبت به بیماری سفیدک جو به دست آید. نیتو و همکاران (۲۰۰۷) از این تکنیک برای تعییین تنوع آللی eIF4E، فاکتوری که حساسیت به ویروس را کنترل می­ کند، در هندوانه استفاده کردند. آن­ها ۱۱۳ ژنوتیپ از گونه­ های کوکومیس را برای حساسیت نسبت به ویروس­های MNSV و CVYV مطالعه و بررسی نمودند. این محققان دریافتند که ۶ محل پلی­مورف به صورت بسیار حفاظت شده در مناطق اگزونی این ژن وجود دارد که یکی از آن­ها با مقاومت نسبت به MSNV مرتبط بوده و بقیه موتاسیون­های خاموش بودند. همچنین آن­ها یک آلل جدید از این ژن را در یکی از خویشاوندان هندوانه به نام کوکومیس زِیری^[۳]، یافتند. آنالیز عملکرد ژن نیز نشان داد که این آلل جدید احتمالاً مسئول مقاومت به MNSV است. راموس و همکاران (۲۰۰۹) با بهره گرفتن از تکنیک اکوتیلینگ یک ارتولوگ هیپو آلرژی از لوکوس Ara h 2.01 را در بادام زمینی تشخیص داده و بررسی کردند. آن­ها به کمک روش اکوتیلینگ ۵ موتاسیون مختلف از بین برنده فعالیت ژن d 2.01 را در ژنوتیپ­های بادام تعیین نمودند. به­ علاوه، یک پلی­مورفیسم در اپی­توپ (بخشی از آنتی­ژن که به وسیله سیستم ایمنی به ویژه آنتی­بادی­ها، سلول­های B و T تشخیص داده می­ شود) غالب ایمنی #۷ (S73T) تشخیص داده شد که موجب کاهش ۹۹- ۵۶ درصدی فعالیت باندینگ IgE گردید. وانگ و همکاران (۲۰۱۰) با بهره گرفتن از تکنیک اکوتیلینگ پلی­مورفیسم­های ژنFAE1 ، که در ارتباط با محتوی اسید اوریک است، را در سه گونه از براسیکا مطالعه نموده و از آن برای تعیین رابطه ژنومی جنس­های گونه براسیکا استفاده نمودند. آن­ها هفت ژنوتیپ براسیکا راپا^[۴]، ۹ ژنوتیپ براسیکا اولراسا^[۵] و ۱۰۱ ژنوتیپ براسیکا ناپوس^[۶] را مورد آزمایش قرار دادند. نتایج این مطالعه نشان داد که ۳ پلی­مورفیسم در دو پارالوگ FAE1 گونه ناپوس یافت گردید که این پلی مورفیسم­ها رابطه قویی با تفاوت مقادیر اسید اوریک بذر داشتند. در توالی­های ژنومی ژن FAE1 متعلق به ۷ ژنوتیپ براسیکا راپا یک پلی­مورفیسم تک نوکلئوتیدی در منطقه کد کننده ژن یافت شد که موجب کاهش عملکرد ژن گردید. آنالیز مولکولی تکامل همولوگ­های ژن FAE1 نشان داد که رابطه بین ژنوم­های A و C در براسیکا نزدیک­تر از رابطه ژنوم­های A/C و ژنوم آرابیدوپسیس است. مرتب کردن توالی­های کد کننده این همولوگ­های FAE1 و مقایسه آن­ها نشان داد که ۱۸SNP متفاوت بین ژنوم­های A و C وجود داشته که می توانند به عنوان مارکرهای اختصاصی ژنوم در براسیکا استفاده گردند. وان هوت و همکاران (۲۰۱۲) مناطق کد کننده ژن سندرم NBS را در ۱۰ فرد مبتلا به این بیماری توالی­یابی کرده و در ۸ نفر از آن­ها در ژن SMARCA2 تنوع­های هتروزیگوسی یافتند. غربالگری گسترده مولکولی نشان داد که در ۳۶ فرد از ۴۴ فرد مبتلا به این سندرم موتاسیون­های ناهمگن در ژن SMARCA2 وجود داشت. هنگامی که این موتاسیون­ها با نمونه­های والدینی مقایسه شدند تأیید گردید که آن­ها موتاسیون­های جدید می­باشند. این موتاسیون­ها در داخل توالی­هایی گروه­بندی شدند که موتیف­های بسیار حفاظت شده در منطقه کاتالیکی ATPase پروتئین را کد می­ کنند. این تکنیک برای تشخیص انواع آلل­های جدید ژنی، بیان رابطه ارتولوگی آن­ها و همچنین رابطه بین ژنوم­های گونه­ های مختلف کاربرد دارد.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

از تکنیک اکوتیلینگ می­توان برای تخمین فراوانی نسبی SNP در قطعه یا قطعات مورد نظر ژنوم استفاده نمود. ارزیابی فراوانی SNP می ­تواند اطلاعات زیادی در مورد مناطق حفاظت شده ژن و مسیر تکاملی جنس­ها و گونه­ های مختلف در اختیار قرار دهد. گیلکریست و همکاران (۲۰۰۶) با بهره گرفتن از این تکنیک، تنوع ژنتیکی در جمعیت طبیعی Populus trichocarpa را مورد مطالعه قرار دادند. آن­ها تنوع ژنتیکی مربوط به ۹ ژن را در افراد ۴۱ جمعیت مختلف بررسی نمودند. مقدار تنوع در ژن­های مورد مطالعه آن­ها بسیار متفاوت بوده و از یک SNP در ژن PoptrTB1 تا بیش از SNP 23 در هر bp 1000 از ژن PoptrLFY متغیر بوده است. الیزا و همکاران (۲۰۰۹) تکنیک اکوتیلینگ را در سیب زمینی (Solanum tuberosum L) بهینه­سازی کردند. آن­ها در هر کیلوباز ۱۵ پلی­مورفیسم تک نوکلئوتیدی یافتند. نه پلی­مورفیسم از آن، مختص یکی از سه رقم تتراپلوئید مورد مطالعه بود. ایبیزا و همکاران (۲۰۱۰) با بهره گرفتن از اکوتیلینگ منابع جدیدی از مقاومت ویروسی را در گونه­ های پنبه یافتند. آن­ها برای ۲۳۳ ژنوتیپ بومی جنس کاپسیکم یک پلت فرم اکوتیلینگ بر مبنای cDNA ارائه داده و ارزیابی نمودند. با بهره گرفتن از این پلت فرم تنوع بالایی در توالی­های کد کننده ژن­های eIF4 و eIF(iso)4E تشخیص داده شد. این محققان ۵ واریانت جدید از ژن eIF4E (pvr210, pvr211, pvr212, pvr213 and pvr214) گزارش دادند که در ارتباط با واکنش مقاومتی نسبت به ویروس PVY بوده است. سِری و همکاران (۲۰۱۱) در ۹۶ ژنوتیپ جو آلل­ها و هاپلوتیپ­های ۹ ژن کاندیدای تحمل به خشکی را مطالعه نمودند. آن­ها SNP 185 گزارش دادند و با تکنیک اکوتیلینگ ۴۶ موتاسیون حذف و اضافه با میانگین یک SNP در bp 92 و یک موتاسیون حذف و اضافه در bp 372 از توالی ژنومی را تعیین نمودند. کلهر و همکاران (۲۰۱۱) مقادیر SNPها در جمعیت­های وحشی Populus tremuloides Michx. را تعیین نموده و مشخص کردند. آن­ها در مجموع ۳۵ منطقه ژنی را در چهار جمعیت آنالیز کردند. لوسای انتخابی آن­ها اصولاً در تشکیل پشم نقش داشتند و شامل ژن­هایی بودند که در بیوسنتز لیگنین، بیوسنتز سلولز و سایر ترکیبات دیواره سلولی دخالت می­نمایند. همچنین ژن­های کد کننده هورمون­های رشد، مقاومت به بیماری و واکنش به نور از جمله ژن­های مورد مطالعه آن­ها در این تحقیق بود. این پژوهشگران مجموعاً ۴۶۲ SNP در kb 25 یافتند که بیش از SNPs/kb 18 می­باشد. بنابراین، SNP ها مارکرهای مولکولی فراوان و مفیدی در این گیاه می­باشند.
برای نقشه­یابی ژن با روشی ساده و کم هزینه می­توان از تکنیک اکوتیلینگ با ژل آگارز استفاده نمود. راقاوان و همکاران (۲۰۰۷) از این روش سریع برای تشخیص SNPها در تهیه نقشه برای ژن­های کاندیدای برنج استفاده کردند. آن­ها از ژل آگارز برای این هدف استفاده نموده و اثبات کردند که این روش می ­تواند به صورت کارآئی در نقشه­یابی ژن به کار رود و به ویژه برای لاین­های والدینی که سطوح پلی­مورفیسم در آن­ها پائین است مفید می­باشد. هزینه کمتر و سادگی این تکنیک موجب کاربرد گسترده­تر آن در مطالعات مربوط به مارکرهای مبتنی بر SNP برای تعیین خصوصیات ژرم­پلاسم و مطالعات نقشه­یابی می­گردد.
روش­های مختلف تشخیص SNP دارای کارآئی متفاوتی می­باشند. اکوتیلینگ با تشخیص انواع مختلف پلی مورفیسم نظیر حذف یا اضافه، آسیب ژنی و توالی های کوچک تکراری بدون تولید موجوداتی که از نظر ژنتیکی تغییر یافته­اند (۱۶)، دارای کارائی بسیار بالایی می­باشد. موتاسیون­های چندتایی و حذف و اضافه­های کوچک با اکوتیلینگ قابل تشخیص­اند. بنابراین، می­توان از این روش به عنوان یک مارکر پلی مورفیسم چند نوکلئوتیدی (MNP) استفاده نمود که از مارکر SNP که صرفاً موتاسیون تک نقطه­ای را تشخیص می­دهد کارآتر است (۷۶). اکوتیلینگ تکنیکی با راندمان بالا است که قابلیت تعیین عملکرد موتاسیون­های نادر توسط آن، مؤثرتر و سریع­تر از سایر روش­ها است (۱۳). هیونگ و همکاران (۲۰۰۸) دو روش استفاده از اندونوکلئاز اختصاصی جفت باز اشتباهی و کروماتوگرافی مایع را برای تشخیص موتاسیون­ها در ژن بتا تالاسمی (HBB) با هم مقایسه نمودند. آن­ها گزارش دادند که روش استفاده از اندونوکلئاز دارای ۱۰۰% حساسیت برای تشخیص موتاسیون است. کورینا و همکاران (۲۰۱۰) از آنالیز هتروروپلکس برای تعیین ژنوتیپ SNP در آفتابگردان استفاده کردند. آن­ها برای ژنوتیپ­یابی مجموعه ­ای از ۲۴ ژن کاندیدای پلی­مورف انتخابی دو روش CEL1CH و dHPLC را با هم مقایسه کردند. ده منطقه از ۲۴ منطقه ژنی دقیقاً به وسیله روش CEL1CH تشخیص داده شده و ۱۱ منطقه ژنی برای آنالیز از طریق dHPLC بهینه­سازی شدند. هر دو روش برای تهیه نقشه ژنتیکی استفاده شدند و برای این منظور SNP 42 از نوع موتاسیون حذف و اضافه در ۲۲ ژنوتیپ آفتابگردان و SNP 33 حذف و اضافه در ۹۰ اینبرد لاین نوترکیب برای تولید این نقشه استفاده گردید. آن­ها نتیجه ­گیری کردند که می­توان این دو روش را به صورت روش­های مکمل برای مطالعات ژنتیکی و تعیین تنوع ژرم پلاسمی (اکوتیلینگ) به­ کار برد. بونو و همکاران (۲۰۱۱) با بهره گرفتن از تکنیک­های اکوتیلینگ و HRM بیماران مبتلا به اندرسون- فابری (FD) را از نظر ژنتیکی غربال کردند. این بیماری به وسیله نقص عمل آنزیم آلفا- گالاکتوزیداز که توسط ژن GLA کد می­ شود، ایجاد می­گردد. نتایج مطالعه آن­ها نشان داد که همه موتاسیون­ها به وسیله روش HRM تشخیص داده شدند، در حالی که ۱۷% از آن­ها با اکوتیلینگ تشخیص داده نشدند. مقایسه نتایج اکوتیلینگ با آنزیم CELI و ENDO-1 به میزان زیادی با هم هم­پوشانی داشتند. جگادسان و همکاران (۲۰۱۱) از اکوتیلینگ به عنوان یک تکنیک مارکری کمکی برای آنالیز مولکولی ژن­های گلیسین در موتانت­های سویا استفاده کردند. آن­ها ژن­های Gy1, Gy2, Gy3 و Gy5 که ذخیره پروتئینی بذر را کنترل می­ کنند را مورد مطالعه قرار دادند. این محققان گزارش نمودند که آنالیز پروتئین بذر با مارکرهای اختصاصی ژن در مقایسه با روش­ SDS- PAGE آسان­تر، سریع­تر و دقیق­تر است و نیاز به در اختیار داشتن بذر نمی ­باشد. همچنین، این آنالیز می ­تواند در هر مرحله از رشد گیاه انجام گیرد. تسای و همکاران (۲۰۱۱) موتاسیون­های نادر در جمعیت­های برنج و گندم را با روش تیلینگ به وسیله توالی­یابی جستجو و مطالعه نمودند. آن­ها با بهره گرفتن از روشی مبتنی بر توالی­یابی ایلومینا، ۷۶۸ نمونه گیاهی از برنج و گندم را به طور موازی و هم زمان آزمایش و بررسی کردند. آن­ها نتیجه ­گیری کردند که این روش در مقایسه با سایر روش­های تیلینگ، مانند برش آنزیمی هترودوپلکس­ها، روش استفاده از dHPLC و HRM، حساسیت بیشتری برای تشخیص پلی­مورفیسم داشته و روشی تخصصی تر است.
تحقیقات اخیر در این زمینه مربوط به توالی یابی ترنسکریپتوم ژن­های مسئول صفات مهم مانند انواع تنش­های زنده و یافتن موتاسیون­های تک نوکلئوتیدی در آن­ها که منجر به تغییر معنی دار عملکرد ژن می­گردد، می­باشد.
مکانیسم ژنتیکی، بیوشیمی و فیزیولوژیکی تحمل به شوری
بیان ژن­های مرتبط با تحمل نسبت به تنش شوری در گیاه جو در مراحل مختلف رشد گیاه بسیار متفاوت است. والیا و همکاران (۲۰۰۷) بیان ژن در طول تنش شوری را در جو آنالیز کردند. نتایج مطالعه آن­ها نشان داد که شکل خاصی از واکنش نسبت به شوری، القای ژن­هایی است که در بیوسنتز اسید جاسمونیک دخالت دارند و ژن­هایی که در پاسخ به تیمار اسید جاسمونیک شناخته شده ­اند. تعداد زیادی از ژن­های مرتبط با تنش­های غیر زنده (مانند گرما، خشکی، و دمای پائین) با واکنش نسبت به شوری در ارتباط­اند. نتایج این پژوهشگران نشان داد که اسموپروتکشن­ها اولین واکنش گیاه جو نسبت به تنش شوری هستند. لی و همکاران (۲۰۰۹) از یک روش RT-PCR متفاوت بر مبنای پرایمر با دمای انلینگ کنترل شده (ACP) برای تشخیص بیان ژن­هایی که در برگ جو تحت تنش شوری به صورت متفاوتی بیان می­گردند (DEGs)، استفاده کردند. آن­ها برخی ژن­های جدید مانند SnRK1- پروتئین کیناز، که ۱۷ کیلو دالتون و کلاس I می­باشند، پروتئین کوچک شوک حرارتی و ماده اولیه پروتئین RNase S-like را تشخیص دادند که این اطلاعات برای توسعه استراتژی­ های بعدی برای تحمل شوری مفید می­باشد. مولر و همکاران (۲۰۰۹) تجمع یون سدیم در شاخه و افزایش تحمل به شوری، که با تغییر نوع خاصی از سلول­های انتقال دهنده یون سدیم در آرابیدوپسیس مهندسی شده است، را مورد بررسی قرار دادند. آن­ها نشان دادند که بیان ژن انتقال دهنده یون سدیم HKT1:1 در سلول­های بالغ ریشه آرابیدوپسیس تالیانا تجمع این یون در شاخه را به میزان ۳۷ تا ۶۴ درصد کاهش داد. بیان HKT1:1 به ویژه در ریشه بالغ با بهره گرفتن از سیستم بیان تقویت شده برای بیان کاملاً اختصاصی و قوی انجام می­گیرد. این عمل در شاخه به کمک HKT1:1 و با افزایش جریان یون سدیم به داخل سلول­های ستاره­ای شکل صورت می­گیرد و موجب کاهش انتقال یون سدیم از ریشه به شاخه می­گردد. گیاهانی که یون سدیم کمتری در شاخه دارند نسبت به شوری متحمل­تر هستند. نتایج مطالعه این محققان نشان داد که تغییر فرایند اختصاصی انتقال یون سدیم در انواع خاصی از سلول­ها می ­تواند تجمع این یون در شاخه را کاهش دهد که این امر جنبه مهمی از تحمل به شوری در بسیاری از گیاهان عالی است. والیا و همکاران (۲۰۰۹) الگوهای بیان ژنومی برنج و جو را در ارتباط با واکنش نسبت به تنش شوری با هم مقایسه نمودند. آن­ها این فرضیه را تأیید کردند که علائم ترنسکریپتومی حفاظت شده در پاسخ به عوامل محیطی وابسته به شباهت ژنتیکی میان ژنوتیپ­های موجود در داخل یک گونه و همچنین وابسته به فاصله فیلوژنی بین گونه­ ها می­باشد. محمدی نژاد و همکاران (۲۰۱۰) با بررسی ژنوتیپی تحمل به تنش شوری در ۳۰ ژنوتیپ برنج در مرحله گیاهچگی آن­ها را بر اساس مارکرهای میکروستلایتSaltol QTL, RM8094 و RM10745 به ۱۶ هاپلوتیپ تقسیم نمودند. دیو و همکاران (۲۰۱۰) تفاوت­های نسخه­برداری و ترجمه ژن دهیدرین را بین واریته جوی تیبتان هیکینک شماره ۱ و جوی وحشی تحت شرایط تنش­های شوری، خشکی و دمای پائین بررسی نمودند تا مکانیسم تحمل به تنش را در واریته تیبتان هیکینک ترسیم کنند. آن­ها گزارش دادند که کمبود الکترولیت، محتوی مالوندیالدهید و H2O2 در جوی وحشی سریع­تر از جوی لخت تیبتان، افزایش می­یابد که این امر نشان می­دهد جوی وحشی بیش از جوی لخت تیبتان، آسیب می­بیند و واریته هیکینک شماره ۱ دهیدرین­های بیشتری نسبت به جوی وحشی حساس به تنش ذخیره می­ کند. کیو و همکاران (۲۰۱۱) تحمل به شوری را در ۱۸۹ ژنوتیپ مشتق شده از جوی وحشی تیبتان که از نظر تحمل به شوری متفاوت بودند با بهره گرفتن از تعیین غلظت­ یون­های سدیم و پتاسیم ارزیابی کردند. همچنین، آن­ها عملکرد آللی HvHKT1 و HvHKT2 را در جوی وحشی تیبتان آنالیز کردند. از نظر تحمل به شوری تنوع وسیعی میان ژنوتیپ­های جوی وحشی وجود داشت. برخی از ژنوتیپ­ها نسبت به رقم زراعی CM 72 جو متحمل­تر بوده و تحمل به شوری به طور معنی­داری وابسته به نسبت یون پتاسیم به یون سدیم بود. آنالیز همبستگی نشان داد که این دو ژن اصولاً انتقال یون سدیم و یون پتاسیم را تحت تنش شوری کنترل می­ کنند که این امر با آنالیز بعدی بیان ژن تأیید گردید. نتایج این مطالعه نشان داد که جوی وحشی تیبتان دارای آلل­های الیت از این دو ژن می­باشد که موجب تحمل به شوری می­گردد. ریواندی و همکاران (۲۰۱۱) یک لوکوس کنترل کننده ذخیره یون سدیم، SOS3 که با HvNaX4 همولوگ بوده و روی بازوی بلند کروموزوم شماره یک جو قرار دارد، را به خوبی نقشه­یابی کردند. ژن HvCBL4 جو یک همولوگ بسیار نزدیک به ژن متحمل به شوری SOS3 در آرابیدوپسیس است که هم زمان با HvNaX4 تفرق می­یابد. آن­ها این لوکوس را روی کروموزوم شماره یک نقشه­یابی کرده و دریافتند که لوکوس HvNaX4 میزان یون سدیم در شاخه را بین ۱۲ و ۵۹ درصد کاهش می­دهد یا بسته به شرایط رشد هیدروپونیک و طیفی از انواع خاک­ها اصلاً این میزان را کاهش نمی­دهد. این امر نشان دهنده تأثیر قوی محیط روی بیان ژن است. این محققان در بیان mRNAی لوکوس HvCBL4 بین والدینی که نقشه­یابی شدند تفاوتی مشاهده نکردند. بنابراین آن­ها گزارش دادند که HvCBL4 یک ژن کاندیدا برای HvNaX4 است که باید بیشتر مورد بررسی و مطالعه قرار گیرد.
تحت تنش شوری غلظت یون­های پتاسیم و سدیم به شدت تغییر می­یابد. تغییر غلظت این یون­ها تحت تأثیر ژن­های کنترل کننده این تنش و طی مسیرهای خاص بیوشیمیایی صورت می گیرد. یکی از راه های مطالعه مکانیسم این ژن­ها استفاده از موتاسیون­های مربوط می­باشد. والیا و همکاران (۲۰۰۷) یک رقم متحمل به شوری در جو به نام گلدن پرامیس که حاصل موتاسیون القائی با پرتوتابی در رقم میتورپ می­باشد را مورد مطالعه قرار دادند. گلدن پرامیس حاصل یک موتاسیون منفرد در لوکوس Ari-e روی کروموزوم شماره ۵ جو است. این رقم یون سدیم کمتری نسبت به رقم والدینی خود در شاخه­ها ذخیره می­نماید و هدف از این مطالعه تشریح اساس ژنتیکی و مکانیسم این تفاوت بوده است. نتایج این تحقیق نشان داد که این دو رقم از نظر ژنتیکی بسیار به هم نزدیک بوده اما ایزوژنیک نمی­باشند و این به دلیل وجود سه بلوک هاپلوتیپ پلی­مورف است. آنالیز­ ترینسکریپتوم نشان داد که واکنش این دو ژنوتیپ به تنش شوری کاملاً متفاوت است. همچنین، واکنش آن­ها نسبت به تنش شوری در بافت ریشه و شاخه بسیار متفاوت است. روش دیگر برای مطالعه این مکانیسم­ها استفاده از رادیو ردیاب­ها می باشد. کودلا و همکاران (۲۰۱۰) عملکرد سیگنال دهی یون کلسیم در گیاهان را مطالعه نمودند. زیرا این یون در واکنش­های متعدد گیاه نسبت به محرک­های زنده و غیر زنده از جمله نور، دمای بالا یا پائین، شوری و خشکی نقش دارد. آن­ها توانستند اصول دقیق مکانیسمی را تشریح کنند که تحت آن تشخیص و تغییر جریان اختصاصی یون کلسیم در سلول به صورت واکنش متقابل پروتئین با پروتئین، فسفریلاسیون پروتئین و بیان ژن تعریف می­گردد و به موجب آن ویژگی پاسخ به تحریک محیطی به طور هم زمان بررسی می­ شود. لیگابا و همکاران (۲۰۱۰) با مقایسه ارقامی از جو که از نظر حساسیت نسبت به شوری متفاوت بودند مکانیسم­های تحمل به شوری را در آن­ها مطالعه کردند. آن­ها واکنش تحمل به شوری را در سطوح فیزیولوژیکی و مولکولی در ارقام متحمل (K305) و حساس به شوری (۱۷۴۳) بررسی نمودند. این محققان گزارش دادند که آنالیز بیان ژن با بهره گرفتن از RT-PCR کمّی نشان داد که تعداد نسخه­های ژن­های انتقال دهنده یون پتاسیم (HvAKT1 و HvHAK1)، H⁺-ATPase واکوئولی و پیروفسفاتاز غیرآلی (HvHVP1 و HvHVA/68) در شاخه­ های KK305 فراوان­تر از ۱۷۴۳ بود. بیان انتقال دهنده­های ژن HvHAK1 و /H⁺ Na⁺ (HvNHX1, HvNHX3 و HvHNX4) هنگام قرار گرفتن طولانی مدت در معرض شوری در ریشه ­های K305 بیش از ریشه ­های ۱۷۴۳ بود. نتایج این مطالعه پیشنهاد می کند که عملکرد بهتر رقم K305 در مقایسه با رقم ۱۷۴۳ در طول تنش شوری ممکن است با قابلیت بیشتر آن برای توقیف یون سدیم در زیر بخش­های سلولی و یا حفظ هموستازی یون پتاسیم مرتبط باشد.
امروزه آنالیز ترکیبی ژن­های مسئول تنش­های زنده در گیاهان همراه با بررسی بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی آن­ها صورت می­گیرد تا از این طریق درک بهتری از مکانیسم عمل این ژن­ها و شناسائی منابع مقاوم با بهره گرفتن از فرآیندهای متأثر از آن­ها انجام گیرد.
فصل دوم- مواد و روش­ها
۲-۱ فرضیات تحقیق
فرضیات این آزمایش شامل تشخیص آلل­ها جدید و گروه­­بندی هاپلیوتیپی ژنوتیپ­های مورد بررسی با بهره گرفتن از تنوع تک نوکلئوتیدی (SNP)، استفاده از تنوع هاپلوتیپی برای طبقه ­بندی اکوتیپ­ها و کاهش هزینه، زمان و افزایش دقت نسبت به سایر روش­های مطالعه تنوع تک نوکلئوتیدی بوده است.
بخش عمده مراحل اجرائی این تحقیق در مرکز بین المللی تحقیقات کشاورزی در مناطق خشک (ICARDA) و بخشی دیگر در پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج (ABRII) انجام گرفته است.
۲-۲ مواد گیاهی
در این تحقیق از ۹۶ ژنوتیپ جو که در مناطق مختلف شور در جهان از جمله ایران کشت می­گردند، به عنوان مواد گیاهی استفاده گردید که لیست اسامی و مشخصات آن­ها در بخش ضمیمه ذکر گردیده است. هدف از انتخاب این مواد بررسی تنوع ژنی مقاومت به شوری در ژنوتیپ­های متعلق به مناطق متعدد جغرافیایی بوده است. زیرا طبق مطالعات قبلی، ژنوتیپ­هایی که در مناطق شور رشد و نمو می­یابند دارای تنوع بیشتری از نظر دارا بودن ژن­های متحمل به شوری می­باشند.
۲-۳ طراحی پرایمر
طراحی پرایمرها با بهره گرفتن از داده ­های ژنومی جو که در پایگاه اطلاعاتی GeneBank موجود است، انجام گرفت. با توجه به اینکه این پرایمرها اختصاصی بوده و برای مطالعه عملکرد ژن طراحی شدند، از مناطق کد کننده ژن به عنوان توالی­های اولیه برای طراحی پرایمر استفاده گردید. ژن های مورد مطالعه در این تحقیق دو ژن متحمل به شوری CBL4و HKT1 بوده است. برای طراحی پرایمرها از نرم افزار آنلاین(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) Primer3 استفاده شد.
۲-۴ مدل ژنی ژن­های استفاده شده برای طراحی پرایمرها
مدل ژنی ژن CBL4 در شکل ۲- ۱ نشان داده شده است. همچنین توالی کامل مناطق کد کننده و غیر کد کننده این ژن در شکل ۲-۲ آورده شده است. مناطق کد کننده به صورت رنگی نمایش داده شده ­اند.
شکل ۲-۱ منطقه کد کننده پروتئین ژن calcineurin B-like protein 4 (CBL4) در رقم Clipper جو
Hordeum vulgare subsp. vulgare cultivar Clipper calcineurin B-like protein 4 (CBL4) gene,complete cds
join(345..429,523..605,698..866,1011..1063,1169..1249,
۱۵۲۳..۱۶۳۵,۱۸۶۵..۱۹۳۷)
/gene="CBL4″
/codon_start=1
/product="calcineurin B-like protein 4″
/protein_id="ADW08757.1″
/db_xref="GI:320090215″
/translation="MGCVSSSPGRSRRAPGYEDPAVLASQTSFTVNEVEALYELYKKL
SYSIFKDGLIHKEEFQLALFRTSKGPSLFADRVFDLFDLKRNGVIEFGEFVRSLSIFH
PKAPESDKAAFAFKLYDLRGTGYIEKEELRELVVALLDESDLCLSDSAVEEIVDNTFS
QADSNGDDRIDPKEWEEFVKKNPASLRNMSLPYLQDITTAFPSFVMHSEVDDYSGISK
شکل۲- ۲ توالی کامل ژن CBL4 و مشخصات منطقه کد کننده و توالی آمینو اسیدی در این ژن
مدل ژنی ژن HKT1 در شکل ۲-۳ نشان داده شده است. توالی مناطق کدکننده و غیرکدکننده ژن HKT1 در شکل ۲-۴ آمده است.
شکل ۲-۳ مدل ژنی ژن HKT1
Hordeum vulgare mRNA for high-affinity sodium transporter (HKT1 gene)
شکل ۲- ۴ توالی کامل ژن HKT1 و مشخصات منطقه کد کننده و توالی آمینو اسیدی در این ژن.
۲-۵ مشخصات پرایمرهای طراحی شده
برای هر یک از ژن­های CBL4 و HKT1 چهار پرایمر طراحی گردید که مشخصات آنها در جدول ۲-۱ ارائه شده است.
جدول ۲-۱ نام و توالی پرایمرهای طراحی شده برای ژن­های HKT1 و CBL4