۲-۶-۱۰ الکتروفورز پروتئین بر روی ژل پلی اکریل آمید (SDS-PAGE)
مقدمه
الکتروفورز در واقع همان حرکت ذرات باردار تحت تأثیر میدان الکتریکی، می باشد. خصوصیات مولکول ها (اندازه، شکل، میزان بار الکتریکی)، شرایط محیطی (قدرت یونی، pH، درجه حرارت و نوع ژل) و فاکتورهای الکتریکی (اختلاف پتانسیل، شدت جریان و ولتاژ) میتوانند در این فرایند مؤثر باشند. از متداول ترین محیط های نیمه جامد برای الکتروفورز پروتئین ها پلی اکریل آمید می باشد که پروتئین ها را در محدوده وزنی ۵۰۰ تا ۲۵۰۰۰۰ دالتون از هم جدا می کند. این ماتریکس، پلیمری از مولکول های خطی اکریل آمید و N و N- متیلن بیس اکریل آمید می باشد. مولکول های بیس اکریل آمید پل های عرضی را بین مولکول های خطی اکریل آمید ایجاد می کنند و تشکیل یک شبکه رشته ای را می دهند که قادرند پروتئین ها را از هم جدا کنند. پلیمریزاسیون این ترکیبات در حضور آمونیوم پرسولفات آغاز می شود و به دلیل سرعت کم این واکنش، از ماده TEMED بعنوان کاتالیزور واکنش پلیمریزاسیون استفاده می شود. عامل اصلی حرکت مولکول های باردار در الکتروفورز، اختلاف پتانسیل (V) بین قطب های مثبت و منفی می باشد. در روش SDS-PAGE پروتئین ها در حضور شوینده یونی SDS، الکتروفورز می شوند. این ماده به اسید های آمینه هیدروفوب پروتئین ها متصل شده و ساختمان طبیعی پروتئین ها را واسرشته کرده و به ازای طول زنجیره پپتیدی بار منفی ثابتی به آن ها اضافه می کند. بنابر این در این نوع الکتروفورز، به دلیل خنثی شدن اثر بار پروتئین ها توسط SDS، پروتئین ها تنها بر اساس اندازه و شکل از هم جدا می شوند(Sambrook, 2001).
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

مواد لازم
- اکریل آمید
- N,N متیلن بیس اکریل آمید
- سدیم دو دسیل سولفات (SDS)
- تریس بازی
- TEMED
- آمونیوم پرسولفات (APS)
- آب مقطر
- رنگ کوماس بلو (شامل کوماسی بریلینت بلو G250، متانول، اسید استیک گلاسیال می باشد)
- بافر نمونه x6 ( شامل تریس بازی، گلیسرول، SDS، برومو فنل بلو و ۲-مرکاپتو اتانول (۲-ME) می باشد)
- بافر تانک X1 (شامل تریس، گلایسین،SDS و آب مقطر می باشد، پیوست ۶).
- الکل ۹۶%
وسایل لازم

• • سیستم الکتروفورز (منبع تغذیه، تانک، شیشه ها، فضا سازها و شانه )

• • سرنگ هامیلتون

روش انجام کار
روش تهیه ژل تحتانی یا جدا کننده (پیوست ۶)

• • ژل تحتانی بر اساس جدول (۳-۱) تهیه می شود. درصد ژل بستگی به وزن مولکولی پروتئین دارد. هر چه وزن مولکولی نمونه، بیشتر باشد از درصد پائین تر ژل استفاده می شود تا پروتئین بهتر بتواند در ژل حرکت کند.

• • محلول ها را تا قبل از اضافه نمودن TEMED اضافه نموده و خوب مخلوط نمایید.

۲-۶-۱۰-۱روش تهیه ژل فوقانی (پیوست ۶)

• • از این ژل به منظور متراکم کردن نمونه پروتئینی استفاده می شود و عموماً از ژل ۴% استفاده می شود. این ژل بر اساس مقادیر جدول(۳-۱) تهیه می گردد.

• • محلول ها را تا قبل از اضافه نمودن TEMED اضافه و به خوبی مخلوط نمایید.

• • صفحات شیشه ای را با آب و الکل ۷۰% کاملاً تمیز کرده و دو فضا ساز بین صفحات شیشه ای قرار دهید و با گیره محکم کنید. در ظرفی جداگانه به ۱ تا ۲ میلی لیتر از محلول ژل تحتانی کل TEMED لازم برای ژل تحتانی را اضافه کرده وتوسط آن سریعاً اطراف قالب شیشه ای و به ویژه انتهای ژل را پوشانده تا از نشت احتمالی جلوگیری شود. قالب شیشه ای بطور عمودی روی سطح صاف قرار داده شود.

• • پس از تهیه ژل تحتانی، TEMED را به آن اضافه کرده و پس از اینکه کاملاً مخلوط شد، داخل قالب شیشه ای تا ارتفاعی که حدود ۳ سانتیمتر فضا برای ژل فوقانی باقی بماند، بریزید.

• • سپس مقداری اتانول ۹۶% را به گونه ای که سطح ژل بهم نخورد، به آرامی در بالای ژل ریخته و صبر کنید تا ژل ببندد.

• • پس از اطمینان از بسته شدن ژل تحتانی، الکل روی ژل را خالی و سطح ژل را چند بار با آب مقطر شستشو دهید.

• • شانه را بین دو شیشه در بالای ژل قرار دهید و سپس به ژل فوقانی تهیه شده، TEMED را اضافه نموده و پس از خوب مخلوط کردن بر روی ژل تحتانی بریزید.

• • پس از اطمینان از بسته شدن ژل فوقانی، شانه را به آرامی خارج و داخل چاهک ها را چندین بار با آب مقطر شستشو دهید. قالب شیشه ای را با گیره به سیستم الکتروفورز وصل کرده و محفظه بالا و پائین سیستم را با بافر تانک پرکنید.

جدول ۲-۱ نحوه تهیه درصدهای مختلف ژل های فوقانی و تحتانی در SDS-PAGE

۲-۶-۱۰-۲ آماده سازی نمونه

• • بر اساس نوع و غلظت نمونه، از بافر نمونه به آن اضافه کرده و به مدت ۵ دقیقه در آب جوش قرار دهید.

• • نمونه ها را با بهره گرفتن از سرنگ هامیلتون در داخل چاهک ها بریزید. مقدار نمونه قرار داده شده در هر چاهک بستگی به اندازه چاهک، میزان خلوص نمونه، روش رنگ آمیزی و نوع بافر نمونه (X2و X6) دارد.

• • سیستم الکتروفورز را به منبع تغذیه وصل نمایید و در صورت استفاده از ولتاژ ثابت، هنگامیکه نمونه داخل ژل فوقانی است از ولتاژ V60 و بعد از ورود نمونه به داخل ژل تحتانی ولتاژ به V130 رسانده شود.

• • پس از اتمام الکتروفورز (رسیدن رنگ نشانه به انتهای ژل)، منبع تغذیه را خاموش کنید. قالب شیشه ای را خارج کرده و فضا سازها بیرون آورده شود. با قرار دادن یکی از فضا سازها بین دو صفحه شیشه ای، شیشه بالایی را جدا نمایید.

• • سپس ژل رنگ آمیزی گردد.